Precaucións para a electroforese en xel de poliacrilamida

· poliacrilamidaO xel debe formarse mediante monómero de acrilamida, material de partida para a polimerización, catalizador e a mestura correcta de sal e tampón.

· acrilamidae o BIS (N,N'-metileno dobre acrilamida) é a matriz de xel en forma de monómero.

· O persulfato de amonio inicia o proceso de polimerización do adhesivo. A formulación da cola require unha solución de persulfato de amonio ao 10 % preparada en auga. A maior parte da información indicaba a necesidade dun uso activo. Non obstante, a solución ao 10 % pódese colocar a 4 ℃ durante varias semanas sen unha perda de actividade significativa. Engadir ata 10 ml e desbotar cando a cola non se agregue.

Consello: A porcentaxe deacrilamidana secuenciación, a cola e a cola de proteínas non son o mesmo. Se usas unha solución de acrilamida: BIS prefabricada, asegúrate de obter a botella correcta.

· TEMED (N, N, N', N'-tetrametil etilendiamina) é un catalizador, nunha botella marrón, colocada no frigorífico. Engádese xusto antes de botar a cola.

· O vidro empregado na electroforese de poliacrilamida debe lavarse antes e despois de cada vez. Despois da electroforese, lavar cun cepillo suave e un pano con auga quente e xabón, enxaugar con auga destilada e deixar secar.

· A humidade e o po poden causar o polímero oco. Antes da electroforese, limpe a placa de vidro cun limpador de cristais e límpea cun cepillo suave. Lave con auga destilada e séquea ben cunha toalliña de papel. Enxágüe con etanol ao 70 % antes de limpar con papel axuda a limpar e acelerar o secado. Engada mostras de acrilamida sucesivamente: BIS, auga, solución tampón, persulfato de amonio, TEMED. Axite ben e verte inmediatamente.

Non é necesario desgasificar a poliacrilamida antes da polimerización. (A acrilamida adoitaba colocarse nun baleiro para eliminar as burbullas porque o osíxeno inhibe a polimerización.)

Puntas de mostra de pegamento horizontal.

· coloca un anaco de papel negro na caixa inferior, con fondo negro para facer un burato na mostra e ver máis claramente.
· tampón cheo de tanque de cola, xusto por riba do coloide.
· se o bordo ten luz, acende as luces, deixa que brille a luz coloidal. Introduce a mostra na pipeta.
· usando un dispositivo de pipeteado automático.
· en 10-200 mu, pódese usar 1 punto de movemento de líquido na maioría dos puntos da mostra. Para orificios de mostra moi pequenos (menos de 10 μ1), a cabeza de pipeta longa utilizada para secuenciar cola é máis cómoda.

· pipetear só mergullado na mostra, inhalando fluído que se move lentamente. A mostra pode parecer pegañenta coa glicerina e un bombeo rápido pode atraer burbullas de aire ao interior da cabeza da pipeta.

· Despois de inhalar as mostras, o cabezal de pipeteo moverá o cabezal de fluído suavemente pola beira do tubo ou, limpando o papel, succionará o cabezal de líquido fóra das pingas. Teña coidado de non succionar a mostra.

Coloque a mostra no burato da mostra

· dispositivo de pipeteo para manter un pouco de presión, facer que as mostras se movan lixeiramente na cabeza do líquido de rebosar.
· a cabeza de pipeta inserida no tampón, lixeiramente máis alta que os orificios puntuais, mantén unha presión positiva. A punta da pipeta pódese inserir nun pequeno orificio.
· lenta e constantemente as mostras cara a fóra. A punta da pipeta colócase enriba do orificio da mostra e a mostra afundirase no orificio. Deixe que a mostra se afunda para encher o orificio da mostra en lugar de empurrar cara a dentro.
· unha vez que a última pinga de mostra con líquido na cabeza, o líquido moverase á segunda perna, subirá lentamente o movemento do líquido, sairá do tampón

Como facer unha mostraxe de cola vertical?

· buratos de mostra con punto de cola vertical formados entre dúas pezas de vidro. En cola moi fina, a cabeza da pipeta nin sequera se pode inserir entre dúas placas de vidro. Coidado coa glicerina! Coloque a cabeza da pipeta sobre o burato da mostra e a mostra afundirase no burato.
· Asegúrese de colocar a mostra no punto vertical do burato da mostra de xel de acil polipropileno para que estea ben enxaugado. Lave a acrilamida non polimerizada e a auga que poida aparecer no fondo do burato da mostra. A auga pode facer que o burato da mostra sexa significativamente máis pequeno. Use unha xiringa de 25 ml ou 50 ml e unha agulla de calibre 18. Verte o tampón de electroforese e enxágüe coidadosamente o burato da mostra.
· Pode ser difícil ver o burato da mostra, pero ao mesmo tempo, o resto é doado. Se hai buratos en exceso, o tampón da mostra pódese analizar con azul de bromofenol.